乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在其病理分型中，大约70%的患者是雌激素受体（EstrogenReceptor,ER）阳性，临床上均需接受内分泌治疗。雌激素受体（ER）抑制剂是内分泌治疗的主要药物，在ER阳性乳腺癌治疗中发挥着不可或缺的作用。
然而，随着ER抑制剂的广泛使用，绝大部分患者在治疗过程中出现耐药。大约三分之一的ER+乳腺癌复发患者中存在自发性活跃的ER突变，主要为YS和DG；而在新增乳腺癌患者中，EGFR过表达导致更差的预后和他莫西芬耐药。如何开发新一代ER抑制剂对抗耐药，是临床药物治疗上的迫切需求。
近日，美国国家科学院院刊PNAS在线发表了题为“DualMechanismEstrogenReceptorInhibitors”的研究论文。该研究设计合成了一类双机制雌激素受体抑制剂（DMERIs），并结合结构生物学研究揭示了一种有效抑制ER活性的全新构象模式，为内分泌耐药性乳腺癌药物研发提供了新策略。
湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室闵鉴副教授为本文第一作者，湖北大学为第一单位。美国伊利诺伊大学香槟分校JohnKatzenellenbogen教授、Scripps研究所KendallNettles教授为共同通讯作者。
图丨论文截图（来源：PNAS）
目前临床上使用的ER抑制剂药物主要分为两类：一类是他莫昔芬及其类似物雷洛昔芬、巴泽多昔芬和拉索福昔芬，这类药物与雌激素竞争性与ER结合，阻止ER的配体结合域（LigandBindingDomain，LBD）募集共激活因子，进而阻碍ER信号介导的转录激活。
这类药物促进ER的AF1（Activationfunction1）结构域的激活，进而导致雌激素信号的不完全阻止，因此被称为选择性雌激素受体调节剂（SERM）；另一类是以氟维司群为代表的选择性雌激素受体下调剂（SERD），这类药物可以显著下调ER蛋白水平。此外，还有多种新型口服活性SERD处于临床研发阶段。
这些药物均包含一个单一的，精准定位的氨基烷基醚链或丙烯酸酯侧链，通过干扰LBD中螺旋12（h12）的正确定位，阻止对共激活因子的有效识别来阻断ER信号通路，通过侧链的“直接拮抗”发挥抑制作用。
图丨代表性药物的化学结构（来源：PNAS）
研究团队在前期研究中以高分辨X光晶体衍射结构为基础，在以5,6-二芳基-7-氧代双环[2.2.1]庚-5-烯N-芳基磺酰胺（5,6-diaryl-7-oxabicyclo[2.2.1]hept-5-eneN-arylsulfonamide,OBHS-N）结构为母核的化合物中观察到一种独特的“间接拮抗”机制，可以完全抑制野生型ER的活性。
研究人员在药物设计中在用于“直接拮抗”作用的侧链之外，还添加了特定基团来引起间接拮抗作用，从而将“直接拮抗”和“间接拮抗”两种不同的分子元素设计在一个配体上。
由此设计合成了一系列双机制ER抑制剂（DualMechanismEstrogenReceptorInhibitors,DMERIs），其中最有潜力的化合物27和化合物29在乳腺癌MCF-7细胞中的抗增殖IC50值分别为0.3和3nM，并特异性靶向ER，对ER蛋白有明显的降解作用。
图丨A)药物设计理念；B)化合物27和29有效抑制MCF-7增殖（来源：PNAS）
随后，研究人员采用含有YS或DG突变的MCF-7细胞，以及EGFR过表达的MCF-7细胞，考察了DMERI在等位基因驱动的抗雌激素抵抗模型中的活性。研究结果发现，DMERI化合物抑制了各种耐药模型的增殖，突出了双重机制拮抗ER作用的重要性。
图丨DMERI化合物在乳腺癌耐药模型中的生物活性（来源：PNAS）
为了进一步研究化合物拮抗作用背后的结构生物学机制，研究人员进行了大量结构生物学研究。以化合物29为例，其对螺旋12产生巨大的干扰，使AF-2（Activationfunction1）结构域表面更加开放而易于接近，更容易结合共抑制因子，以获得更完全的增殖拮抗。
此外，这些DMERI引起LBD的非典型结构扰动，并稳定了二聚体内的多种拮抗亚态，从而在ER阳性乳腺癌细胞和等位基因特异性耐药模型中产生高效的增殖拮抗作用。
为更深入地探究DMERIs的非典型活动，研究人员采用MicroarrayAssayforreal-timeCoregulator-Nuclearreceptorinteraction(MARCoNI)作为溶液结构探针，检测了DMERIs的全长ER-WT或ER-YS复合物与阳性对照的ER激动剂、SERM和SERD化合物的相互作用。
通过对核受体中种不同共调节因子的相互作用模式分析发现，DMERIs的独特溶液结构具有重要的功能特征来干扰ER激动构象，而传统的单一机制抑制剂（无论是SERM还是SERD）对激动构象起稳定作用，这一观点通过氢氘交换质谱HDX研究进行了进一步验证。
图丨X光衍射晶体结构分析及氢氘交换质谱研究结果（来源：PNAS）
这项研究跳出了传统的核受体变构固定思维，极大地扩展了不作为拮抗主要驱动因素的配体侧链的潜在设计原则，将两种化学靶向方法“直接拮抗”和“间接拮抗”结合到单一配体中，并结合多种结构生物学研究手段探明了结构机制，为新的ER定向疗法提供了一个灵活的平台，为内分泌耐药性乳腺癌的药物研发开拓了新的思路。
